Terapia fotodinâmica em células de tumores pancreáticos humanos: eficiência e análise das vias mediadoras de citotoxicidade / Photodynamic therapy in human pancreatic tumors: efficiency and analysis of cytotoxicity mediator pathways

O adenocarcinoma de ducto pancreático (PDAC) é a quarta causa de morte em decorrência de neoplasias nos países ocidentais. Atualmente, a cirurgia ressectiva é a única possibilidade de cura para a doença, porém, a recidiva tumoral acontece em menos de um ano após a intervenção cirúrgica, mesmo com a quimioterapia adjuvante. A terapia fotodinâmica (PDT) é uma alternativa promissora no tratamento do câncer. No entanto, pouco se sabe sobre o uso da PDT em tumores pancreáticos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da PDT com o azul de metileno (MB) como fotossensibilizador (MB-PDT) em induzir a morte de linhagens de PDAC humanas (AsPC-1, Panc-1, MIAPaCa-2 e BxPC-3) e estudar a contribuição de vias de necrose regulada nos efeitos citotóxicos da terapia sobre estes modelos. Os resultados obtidos mostraram que a MB-PDT foi capaz de induzir a morte massiva das células de PDAC. Além disso, eles indicaram que há dois perfis de susceptibilidade entre as quatro linhagens estudadas quando submetidas a MBPDT com 4,5 J/cm2 de energia e 6min de irradiação. De acordo com os dados apresentados, a diferença nas sensibilidades das linhagens à terapia não está associada à diferenças na capacidade de incorporação do MB ou na localização sub-celular do fotossensibilizador nas diferentes células, uma vez que a localização é, predominantemente, lisossomal em todas elas. Adicionalmente, mostrou-se que as linhagens menos susceptíveis ao tratamento, MIAPaCa-2 e Panc-1, apresentam níveis significativamente menores de RIPK3 e MLKL, dois dos componentes do necrossomo, essenciais para a execução da necroptose. Além disso, foi visto que a MB-PDT induz um aumento de fosforilação de MLKL em AsPC-1, demonstrando a ativação da necroptose após a terapia nestas células, mas não em MIAPaCa-2 (menos responsiva à terapia com 4,5 J/cm2 deenergia e 6min de tempo de irradiação). Ainda, a inibição da via de sinalização necroptótica diminuiu significativamente as porcentagens de morte das células mais susceptíveis (BxPC-3 e AsPC-1), não alterando a resposta de Panc-1 e MIAPaCa-2, corroborando a ativação e importância da necroptose para a citotoxicidade da MB-PDT. Finalmente, neste trabalho foi mostrado que o aumento do tempo de irradiação, mantendo-se a quantidade total de energia aplicada no tratamento, melhora a eficiência da MB-PDT em induzir a morte das células que apresentam limitações para executar a necroptose, sugerindo que mais de uma via de morte esteja sendo ativada após a terapia e que o tempo de irradiação atuaria modulando esta ativação. Complementarmente, foi mostrado que os tempos maiores de irradiação aumentam o estresse oxidativo intracelular que é acompanhado por uma diminuição significativa do conteúdo intracelular de glutationa reduzida (GSH), indicando, preliminarmente, que a ferroptose pode estar sendo acionada após os protocolos mais longos de irradiação. Coletivamente, os resultados apresentados neste trabalho confirmam a eficiência da MB-PDT no tratamento de diferentes linhagens de PDAC, indicando que a necroptose está sendo ativada e contribuindo para a citotoxicidade da terapia sobre as células que não apresentam resistência à esta via de morte. Ainda, eles demonstram que o aumento do tempo de irradiação pode transpor a barreira de resistência de algumas linhagens à terapia, provavelmente por induzir a ativação de outras vias de necrose regulada, mostrando a importância da otimização do protocolo de tratamento no aumento da eficiência da MB-PDT sobre os tumores de pâncreas. Finalmente, os resultados confirmam a MB-PDT como alternativa eficaz no tratamento do PDAC, apresentando um amplo espectro de atuação sobre subtipos tumorais resistentes à vias clássicas de morte celular, uma característica importante no contexto de uma terapia anti-cancer

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of death due to neoplasms in western countries. Currently, resective surgery is the only therapetical approach to cure this disease, but tumor´s recurrence occurs less than one year after the surgery, even with adjuvant chemotherapy. Photodynamic therapy (PDT) is a promising alternative for the cancer treatment. However, the efficacy of PDT to treat pancreatic tumors as well as the mechanisms involved in the induction of tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to evaluate the efficacy of PDT using methylene blue (MB) as a photosensitizer (MB-PDT), in inducing death of human PDAC derived cell lines (AsPC-1, Panc-1, MIAPaCa-2 and BxPC-3) and to deeper investigate the contribution of necroptosis to the cytotoxic effects of the therapy. We observed that MB-PDT was able to induce massive death of PDAC cells. Moreover, our results indicated that upon MB-PDT (4.5 J/cm2 energy and 6min of irradiation time), there were two susceptibility profiles among the four cell lines studied. Data also showed that this differential profile of cell response was neither associated with the differences in the MB incorporation capacity nor with the subcellular location of the photosensitizer, since the localization was predominantly lysosomal in all of tested cell lines. In addition, less susceptible cells, MIAPaCa-2 and Panc-1, showed significantly lower levels of RIPK3 and MLKL, two of the necrosome components, essential for triggering necroptosis. Furthermore, while MB-PDT (4.5 J/cm2 and 6min of irradiation) has been able to increase MLKL´s phosphorylation levels, an essential step in necroptosis induction, in AsPC-1cells, less responsive MIAPaCa-2 cells presented no variations on the phosphorylation state of this pseudokinase. Moreover, pharmacological inhibition of the necroptotic signaling pathway significantly decreased cell death percentages of the most susceptible cells (BxPC-3 andAsPC-1), without altering the response of Panc-1 and MIAPaCa-2, corroborating that activation of necroptosis was strongly involved in the cytotoxicity of MB-PDT. Finally, this work showed that increasing the irradiation time improved the efficacy of MB-PDT in killing cells which display limitations to perform necroptosis, suggesting that the irradiation time would be modulating the degree of oxidative stress generated and this stimuli would in turn, be responsible for triggering other regulated cell death pathways in a RIKP3 and MLKL independent way. Indeed, this increase in oxidative stress was accompanied by a significant decrease in GSH, a global indicatior of less antioxidant cell capacity, preliminarily pointing at the induction of ferroptosis by longer irradiation protocols. In summary, we demonstrated that MB-PDT is able to induce cell death in different PDAC cell lines and that different regulated cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction. Furthermore, it was demonstrated that increased irradiation time may overcome the resistance barrier of some cell lines, probably inducing the activation of other regulated cell death pathways, showing the importance of optimizing the irradiation protocol in order to maximize the efficacy of the therapy. Finally, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for pancreatic cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors displaying different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy

Estudo das vias de sinalização mediadoras dos efeitos citotóxicos da terapia fotodinâmica em células de tumores mamários humanos / Unvealing the signaling pathways involved in the cytotoxic effects of photodynamic therapy in human breast cancer cells

O câncer de mama apresenta-se como um dos maiores problemas de saúde pública no mundo por ser, entre as mulheres, o primeiro em incidência e o segundo em número de óbitos. Este tipo de câncer apresenta alto grau de recorrência devido a falha no tratamento do tumor primário e o aparecimento de metástases da doença é a principal causa de mortalidade. As estratégias de tratamento nesse estágio não são específicas e comprometem a qualidade de vida das pacientes. A terapia fotodinâmica (PDT) aparece como uma alternativa terapêutica promissora. No entanto, a eficácia da PDT para o tratamento de tumores da mama, bem como os mecanismos que conduzem à morte celular permanecem obscuros. Para este propósito, neste estudo, nos propusemos a investigar mais profundamente os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida MB-PDT. Observou-se que a MB-PDT induz massiva morte celular em células tumorais preferencialmente. As células não-tumorigênicas foram significativamente mais resistentes à terapia em comparação com as células malignas. Análises morfológicas e bioquímicas das células em processo de morte apontou para mecanismos alternativos à apoptose clássica. A autofagia induzida por MB-PDT resultou em citoproteção ou citotoxicidade, dependendo do modelo de célula utilizado. No entanto, o comprometimento de uma destas vias não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. Ao analisar os mecanismos de necrose regulada, observamos que a necroptose desempenhou um papel importante na morte celular induzida por MB-PDT. Adicionalmente, nossos resultados mostraram uma localização preferencial do MB nos lisossomos, o que nos levou a analisar o comprometimento destas organelas. Nós demonstramos por meio da atividade de catepsinas no citosol das células tratadas com MB-PDT, evidências de que a permeabilização da membrana lisossomal é outro mecanismo de necrose regulada responsável pelos efeitos citotóxicos da MB-PDT. Além de resistência à morte celular, as células tumorais também desenvolvem mecanismos de evasão do sistema imune. Neste estudo, também demonstramos que a MB-PDT tem o potencial de aumentar o número de células de linfócitos T CD4+. Por fim, também mostramos a eficácia da terapia em induzir morte celular seletiva às células tumorais em um modelo que recapitula a morfologia do epitélio glandular. Em resumo, demonstramos que vários mecanismos de morte celular são ativados por MB-PDT, uma vez que o comprometimento de uma via de morte celular não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. No geral, os resultados obtidos nesta tese apontam a MB-PDT como uma terapia alternativa e eficaz para o tratamento do câncer de mama, exibindo uma ação de amplo espectro em células com diferentes mecanismos de resistência a vias de morte celular clássica, uma propriedade fundamental para uma terapia contra o câncer. Finalmente, as nossas observações destacam o potencial de MB-PDT como uma estratégia altamente eficaz para tratar o câncer de mama com segurança e possivelmente outros tipos de tumores

Breast cancer is the main cause of mortality among women presenting high recurrence due to primary treatment failure. Photodynamic therapy (PDT) appears as a promising therapeutic alternative. However, the efficacy of PDT to treat breast tumors as well as the mechanisms that lead to tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to deeper investigate the molecular mechanisms involved in MB-PDT induced cell death. We observed that MB-PDT differentially induces massive cell death of tumor cells. Non-malignant cells were significantly more resistant to the therapy compared to malignant cells. Morphological and biochemical analysis of dying cells pointed to alternative mechanisms rather than classical apoptosis. MB-PDT-induced autophagy resulted in either cytoprotection or cytotoxicity depending on the cell model used. However, impairment of one of these pathways did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. When analyzing regulated necrosis mechanisms, we observed that necroptosis played an important role in MB-PDT-induced cell death. Additionaly, our results have shown preferential lysosomal MB localization. Furthermore, we have also presented evidences that the lysosome membrane permeabilization is another regulated necrosis mechanism responsible for MB-PDT cytotoxic effects. It is known that in addition to resistance to tumor cell killing therapies, malignant cells develop molecular mechanisms in order to evade the immune system. In this study, we have also been able to show that the MB-PDT has the potential to increase the number of T lymphocytes CD4+. Additionally, when using a physiological 3D culture model that recapitulates relevant features of normal and tumor breast tissue morphology, we found that MB-PDT differential action in killing tumor cell was even higher than what was detected in 2D cultures. In summary, we demonstrated that different cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction, since impairment of only one cell death pathway did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. Overall, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for breast cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors with different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy. Finally, our observations underscore the potential of MB-PDT as a highly efficient strategy to safely treat breast cancer and possibly other types of tumors

O Papel do óxido nítrico na patogênese da leptospirose experimental em hamsters e camundongos / The role of nitric oxide in the pathogenesis of experimental leptospirosis in hamsters and mice

A patogênese da leptospirose é pouco compreendida e os estudos com. enfoque na resposta inflamatória sistêmica ou local são escassos, em especial no que se refere ao papel do óxido nítrico (NO) e da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS). Dados de ensaios em culturas de células renais sugerem um papel importante da liberação de mediadores inflamatórios, tais como NO, na resposta às leptospiras e consequente nefrite intersticial. A transposição destes achados para o modelo in vivo foi pouco explorada. Por outro lado, estudos em humanos sugerem que a liberação sistêmica de NO correlaciona-se com a gravidade da doença renal e, portanto, pode ser um potencial alvo para terapia adjuvante à antibioticoterapia. O presente trabalho estudou a correlação da iNOS com distúrbios hidroeletrolíticos na patogênese da leptospirose. No modelo experimental de hamsters, avaliamos a associação da inibição dos efeitos do NO, através da terapia combinada de antibioticoterapia padrão e azul de metileno, com distúrbios eletrolíticos, alterações histopatológicas em hamsters e sobrevida. Nenhum benefício da terapia adjuvante com azul de metileno foi demonstrado. No modelo de camundongos transgênicos, investigamos o efeito da ausência do gene da iNOS na nefrite intersticial e na quantidade de bactérias observadas nos tecidos. A ausência do gene iNOS esteve associado a menor frequência de nefrite intersticial grave. Maiores estudos são necessários para investigar a função da inibição da produção de NO na patogenia da doença e da nefrite associada a leptospirose.

The pathogenesis of leptospirosis is poorly understood, and there are few studies fusing on the systemic or local inflammatory responses, especially referring to the role of nitric oxide (NO) and the enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS). Data from in vitro studies suggest an important role of inflammatory mediators, such as NO, in the response to leptospires in the development of interstitial nephritis. The transposition of these findings to an in vivo model was little explored. However, studies in humans suggest that systemic liberation of NO is correlated with severity of renal disease and therefore can be potential target to adjuvant therapy along with antibiotic therapy. The present work evaluated the correlation of iNOS with the pathogenesis of leptospirosis. In the experimental hamster model, we evaluated the effect of inhibiting downstream effects of NO on electrolytic disorders, histopathological changes and survival. No benefit of methylene blue treatment could be observed when compared to antibiotic (ampicillin) therapy only. In the mouse transgenic model, we investigated the effect of the absence of the Inos gene in interstitial nephritis and in the bacterial burden in target tissues. The absence of a functional iNOS gene was associated with lower frequency of severe interstitial nephritis.

Simultaneous determination of naphazoline hydrochloride, chlorpheniramine maleate and methylene blue in their ternary mixture

Validated spectrophotometric and chemometric methods were developed for determination of Naphazoline Hydrochloride [NAP], Chlorpheniramine maleate [CLO] and Methylene blue [MB] in their ternary mixture. Method A was a spectrophotometric method, where NAP and MB were determined using second derivative [D2] spectrophoto metric method using the peak amplitudes at 299 nm and 337 nm for NAP and MB respectively, while CLO was determined using second derivative ratio [DD[2]] spectrophotometric method using the peak amplitude at 276.6 nm. Method B used the chemometric techniques; principal component regression [PCR] and partial least squares [PLS] for determination of NAP, CLO and MB using the information contained in the absorption spectra of their ternary mixture solutions. The proposed methods have been successfully applied for the analysis of NAP, CLO and MB in their pharmaceutical formulation and the obtained results were statistically compared with the reported methods

Concentraciones séricas de cobre en evaluación de respuesta a quimioterapia primaria en cáncer de mama / The serum concentration of cupper in the response evaluation to primary chemotherapy in breast cancer

El objetivo principal de este estudio fue determinar la utilidad de las concentraciones séricas de cobre en la evaluación de la respuesta a quimioterapia primaria en pacientes con cáncer de mama, actualmente no se cuenta con un marcador sérico que permita evaluar dicha respuesta. Se evaluó la variación en los niveles de cobre sérico, en seis pacientes con cáncer de mama localmente avanzado, antes de cada ciclo de quimioterapia primaria y se correlacionó con la respuesta clínica por medición del tamaño del tumor y la respuesta imaginológica por mamografía. Los resultados obtenidos indican que las variaciones séricas de cobre no se correlacionaron con la respuesta clínica (P=0,70), ni imaginológica (P=0,43) a la quimioterapia. En nuestra serie, el cobre sérico no mostró utilidad como marcador para la evaluación de respuesta a quimioterapia primaria en cáncer de mama.

The main objective of this study was to determine the usefulness of the serum copper in the evaluation of response to primary chemotherapy in patients with diagnostic of breast cancer, which currently we does not have a serum marker to evaluate the response. The variation in the serum copper levels was evaluated in six patients with locally advanced breast cancer before each cycle of primary chemotherapy and correlated it with clinical response by measuring tumor size and the response imaging by mammography. The results indicate that variations in the serum copper is not correlated with clinical response (P =0.70) nor imaging response in mammography (P = 0.43) to the chemotherapy. In our series, the serum copper was not useful as a marker for assessing response to the primary chemotherapy in the diagnostic of breast cancer.

Dentin penetrability evaluation of three different dyes in root-end cavities filled with mineral trioxide aggregate (MTA)

A proposta deste trabalho foi avaliar a penetração de três corantes em retrocavidades obturadas com MTA. As retrocavidades foram confeccionadas com aparelho de ultra-som em 30 dentes unirradiculares e obturadas com MTA. Os espécimes foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 10) e imersos nas seguintes soluções corantes: azul de metileno a 2% (MET), nitrato de prata a 50% (NIT) e rodamina B a 0,2% (ROD). Duas fatias transversais (1 mm) da região retrobturada foram obtidas e avaliadas através do software Image Tool 3.0, objetivando quantificar a área (em mm2) de penetração do corante ao redor das retrobturações. Os dados foram submetidos à análise estatística, utilizando o teste t de Student. A menor área de penetração foi observada no grupo NIT, nas duas fatias (p < 0.05). A penetração de corante foi significativamente maior no grupo ROD quando comparado ao grupo NIT, nas duas fatias (p < 0.05), e ao grupo MET, somente na fatia 1 (p < 0.05). Dentro das limitações desta pesquisa, concluiu-se que a escolha da solução corante pode influenciar a avaliação da penetração em estudos sobre retrobturações e que o grupo NIT teve a menor capacidade de penetração na dentina apical.